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共焦点顕微鏡の原理

一般の光学顕微鏡では、視野全面を同時に照明、観察するために、焦点外で発生する光や散乱した光が所謂ボケとして重畳し、画像の鮮鋭さを損ないます。これに対して共焦点顕微鏡は、ピンポイントで１点を照明し、その1点からだけの光を選択的に検出し、その点をスキャンすることで鮮鋭な画像を得ることができます。
共焦点顕微鏡は、対物レンズの像面（共焦点）に点光源とピンホールを配置し、スキャン機構を持つことを特徴とします。点光源として通常レーザを使用し、その光は対物レンズで縮小され焦点面の極小な1点を照明します。この1点で発生した蛍光は逆経路を経て、ダイクロイックミラー(DM)でレーザ光と分離され、共焦点位置に集光してピンホールを通過し受光素子で検出されます。焦点外で発生する光は共焦点位置では集光できずピンホールで遮られるため、焦点からの光のみを選択的に検出することになります。このままでは点情報なので、ガルバノミラーなどで面内をスキャンし、その位置情報と受光素子の検出光量から２次元画像を形成します。さらに焦点を変えた２次元画像を取得し、それらを重ねて３次元画像を構築することもできます。

CSUの原理

一般の共焦点顕微鏡はガルバノミラーによってシングルビームでスキャンするのに対し、CSUはスピニングディスクによってマルチビームでスキャンします。
スピニングディスク共焦点は、ディスクに多数ピンホールを螺旋状に配置、共焦点顕微鏡の点光源かつピンホールとし、このピンホールアレイディスクを回転させることによってスキャンします。このディスクは古く1884年に映像伝送用に発明され、発明者にちなんでニポウディスクとも呼ばれます。しかし、共焦点顕微鏡としては照明光のほとんどがピンホールで遮られるためS/Nが悪く、サンプルが暗い生物用としては普及しませんでした。
CSUでは、もう1枚同じ螺旋状にマイクロレンズを配置したマイクロレンズアレイディスクをピンホールアレイディスクの上方に配置し、マイクロレンズでレーザ光を集光することでピンホールを通し、S/Nを劇的に向上させました。
レーザ光を平行かつ視野をカバーするまで広げ、2枚のディスクを通して個々のマイクロレンズ‐ピンホール対でマルチビームを形成します。マルチビームは対物レンズを介してサンプルを多点で照明し、そこで発生した蛍光は同じピンホールを通過し、ダイクロイックミラーでレーザ光と分離、反射してカメラに結像します。ディスクの回転とともに蛍光のマルチビームがカメラの撮像面を塗りつぶしてゆき、ディスクパターンの1周期（1螺旋分の回転）でちょうど塗りつぶされ、1画像が形成されます。このスキャンでは、ビーム数だけ画像形成は速くなりますが、ビーム数だけ暗くなります。明るくするためには、元のレーザ光を強くするか、多重スキャンすることが必要です。カメラの露光時間をスキャン1周期時間の整数倍に設定することで多重スキャンになります。
スピニングディスク共焦点では、ディスクの回転によってスキャンするため、回転で均一なスキャンを実現するピンホールの配置が必要です。CSUでは内周から外周へ送りが一定かつ密度が均一になる等ピッチ螺旋配置を採用し、均一なスキャンを実現しています。 

CSUの特徴

ライブセルイメージングのデファクトスタンダード  

• 高速に全視野の共焦点画像を得られるため、動くものの観察に適します。
• 低退色・低光細胞毒性のため、生細胞・生体を長期間観察するのに適します。 

CSUは視野内を約1000本のビームでスキャンします。1本のビームを1000本のビームに分割して並行スキャンすると1/1000の時間でスキャンできますが、ビーム当たりのパワーが1/1000になるため、同じ明るさを得るにはビームを1000倍強くするか、1000回多重スキャンする必要があります。
多重スキャンすると結局同じ時間かかりますが、そこに別の大きなメリットがありました。蛍光退色や光細胞毒性は非線形で、強い光で1回スキャンするより弱い光で多重スキャンする方が顕著に少なくなるのです。実際のCSUでは、ビームパワーも上げ、サンプルに合わせて明るさと速さと蛍光退色・光細胞毒性のバランスをとる条件を探しますが、その自由度が高いことが大きなメリットです。
ガルバノミラー共焦点は、レゾナントスキャナを使って高速化し、高感度PMTを使ってレーザパワーを下げて低ダメージ化するなどの改善を行っていますが、本質的に並行スキャンでないため多重スキャンできず、CSUのような自由度がありません。
例えば、ガルバノミラー共焦点ではレーザ1mW30fps（33ms）の条件でぎりぎりの明るさで動きが捉えられるが退色があって長時間観察ができない場合、CSU-X1ではレーザ3ｍW11mS露光（1000fpsとして11回多重スキャン）のように、低退色かつ速く明るい画像を得る条件を探すことができます。

ハイコンテントアナリシス

高精細画像でHigh Content Analysisの新しい世界へ

ハイスループット細胞機能探索システムCellVoyagerは、最大細胞に薬の候補となる化合物を投与し、細胞内の変化などを世界最高レベルの高分解能で撮影、得られた画像を処理して化合物投与による影響を確認するまでの過程を、自動的にかつ世界最高レベルの測定スピードで実現することができる画期的な創薬支援システムです。
共焦点スキャナユニットを利用した画像観察機構、多数のサンプルを高速に観察するための精密位置決め技術による駆動機構、サンプルとなる細胞を培養するインキュベーション機構などの技術と、独自のシステム構築ノウハウでお客様の信頼に答えるべく、最適なソリューションを提案、提供いたします。

ハイコンテントアナリシス（HCA)とは

細胞画像データを利用した研究手法のひとつで、対象の細胞を個別にかつ複数のパラメータについて経時的かつ詳細に調べることを目的としたシステムです。
より複雑な細胞イベントや表現型の研究が可能なため、次世代の新薬開発や創薬研究のための新しいツールとして、大きな期待を集めています。

参考文献

• 実験医学別冊　注目のバイオ実験シリーズ
  ｢初めてでもできる共焦点顕微鏡活用プロトコール｣　高田邦昭／編 羊土社　（2003）
   
• Methods in Cell Biology Vol. 70 Cell Biological Application of Confocal Microscopy Second Edition Brian Matsumoto: AcademicPress(2002)
   
• Confocal Microscopy for Biologists, 
  Alan Hibbs,　Kluwer Academic / Plenum Publishers(2004)
   
• Live Cell Imaging, A Laboratory Manual
  Edited by Robert D. Goldman & David L. Spector. 2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press (2010)
   
• Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd Edition
  Edited by James B. Pawley, Springer(2006)
   
• ポストゲノム時代の実験講座シリーズ｢GFPとバイオイメージング｣
  蛍光タンパク質の発現と検出の基本から生体機能の可視化まで 
  宮脇敦史／編 羊土社　(2000)
   
• 別冊実験医学｢バイオイメージングでここまで理解(（わか）)る｣
  多分子の動態パターンや１分子ごとの動きを蛍光，リアルタイムでみる！ 
  楠見明弘，小林剛，吉村昭彦，徳永万喜洋／編 　羊土社(2002) 
   
• ビデオ顕微鏡　その基礎と活用法
  Shinya Inoue,Kenneth Spring著／寺川進,市江更治、渡辺昭訳　共立出版　(2001)
   
• VideoMicroscopy,　The　Fundamentals,　Shinya Inoue, Kenneth Spring, Second　Edition　Plenum Press. New York,(1997)
   
• Nature 424, 1074 - 1078 (28 August 2003)
  Determining the position of the cell division plane
  JULIE C. CANMAN, LISA A. CAMERON, PAUL S. MADDOX ARON STRAIGHT,JENNIFER , S. TIRNAUER, TIMOTHY J. MITCHISON, GUOWEI FANG, TARUN M. KAPOOR & E. D. SALMON
   
• Nature 418,- 983- 988 (29 August 2002)
  T-cell engagement of dendritic cells rapidly rearranges MHC class II transport
  Marianne Boes, Jan Cerny, Ramiro Masso, Marjolein Op den Brouw, Tom Kirchhausen, Jianzhu Chenk & Hidde L. Ploegh