ライフサイエンス

横河の共焦点：CSU(Confocal scanner unit)の原理

一般の共焦点顕微鏡はガルバノミラーによってシングルビームでスキャンするのに対し、CSUはスピニングディスクによってマルチビームでスキャンします。
スピニングディスク共焦点は、ディスクに多数ピンホールを螺旋状に配置、共焦点顕微鏡の点光源かつピンホールとし、このピンホールアレイディスクを回転させることによってスキャンします。このディスクは古く1884年に映像伝送用に発明され、発明者にちなんでニポウディスクとも呼ばれます。しかし、共焦点顕微鏡としては照明光のほとんどがピンホールで遮られるためS/Nが悪く、サンプルが暗い生物用としては普及しませんでした。
CSUでは、もう1枚同じ螺旋状にマイクロレンズを配置したマイクロレンズアレイディスクをピンホールアレイディスクの上方に配置し、マイクロレンズでレーザ光を集光することでピンホールを通し、S/Nを劇的に向上させました。
レーザ光を平行かつ視野をカバーするまで広げ、2枚のディスクを通して個々のマイクロレンズ‐ピンホール対でマルチビームを形成します。マルチビームは対物レンズを介してサンプルを多点で照明し、そこで発生した蛍光は同じピンホールを通過し、ダイクロイックミラーでレーザ光と分離、反射してカメラに結像します。ディスクの回転とともに蛍光のマルチビームがカメラの撮像面を塗りつぶしてゆき、ディスクパターンの1周期（1螺旋分の回転）でちょうど塗りつぶされ、1画像が形成されます。このスキャンでは、ビーム数だけ画像形成は速くなりますが、ビーム数だけ暗くなります。明るくするためには、元のレーザ光を強くするか、多重スキャンすることが必要です。カメラの露光時間をスキャン1周期時間の整数倍に設定することで多重スキャンになります。
スピニングディスク共焦点では、ディスクの回転によってスキャンするため、回転で均一なスキャンを実現するピンホールの配置が必要です。CSUでは内周から外周へ送りが一定かつ密度が均一になる等ピッチ螺旋配置を採用し、均一なスキャンを実現しています。 

マイクロレンズ付ニポウディスク

マイクロレンズの効果

スキャン方式の比較

CSUのディスクスキャン
回転速度＝10000 [rpm]=41.7[rps]
30度/画像
画像形成　1÷( 41.7×30/360 )＝ 0.5 [ms]

ポイントスキャン
1ラインスキャンの所要時間＝1[ms]
1000 ライン/画像
画像形成　1×1000＝1000 [ms]

 展示会情報

参考文献

• 実験医学別冊　注目のバイオ実験シリーズ
  ｢初めてでもできる共焦点顕微鏡活用プロトコール｣　高田邦昭／編 羊土社　（2003）
   
• Methods in Cell Biology Vol. 70 Cell Biological Application of Confocal Microscopy Second Edition Brian Matsumoto: AcademicPress(2002)
   
• Confocal Microscopy for Biologists, 
  Alan Hibbs,　Kluwer Academic / Plenum Publishers(2004)
   
• Live Cell Imaging, A Laboratory Manual
  Edited by Robert D. Goldman & David L. Spector. 2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press (2010)
   
• Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd Edition
  Edited by James B. Pawley, Springer(2006)
   
• ポストゲノム時代の実験講座シリーズ｢GFPとバイオイメージング｣
  蛍光タンパク質の発現と検出の基本から生体機能の可視化まで 
  宮脇敦史／編 羊土社　(2000)
   
• 別冊実験医学｢バイオイメージングでここまで理解(（わか）)る｣
  多分子の動態パターンや１分子ごとの動きを蛍光，リアルタイムでみる！ 
  楠見明弘，小林剛，吉村昭彦，徳永万喜洋／編 　羊土社(2002) 
   
• ビデオ顕微鏡　その基礎と活用法
  Shinya Inoue,Kenneth Spring著／寺川進,市江更治、渡辺昭訳　共立出版　(2001)
   
• VideoMicroscopy,　The　Fundamentals,　Shinya Inoue, Kenneth Spring, Second　Edition　Plenum Press. New York,(1997)
   
• Nature 424, 1074 - 1078 (28 August 2003)
  Determining the position of the cell division plane
  JULIE C. CANMAN, LISA A. CAMERON, PAUL S. MADDOX ARON STRAIGHT,JENNIFER , S. TIRNAUER, TIMOTHY J. MITCHISON, GUOWEI FANG, TARUN M. KAPOOR & E. D. SALMON
   
• Nature 418,- 983- 988 (29 August 2002)
  T-cell engagement of dendritic cells rapidly rearranges MHC class II transport
  Marianne Boes, Jan Cerny, Ramiro Masso, Marjolein Op den Brouw, Tom Kirchhausen, Jianzhu Chenk & Hidde L. Ploegh

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