横河電機株式会社
横河ソリューションサービス株式会社

スフェロイド解析

はじめに

スフェロイド形成された細胞は、単層に培養された2次元組織体に比べ、より生体に近い構造と機能を持つことが確認されています。そのため、様々なスフェロイドの作成手法の開発・データの蓄積が進んでいます。そこで、CellVoyager CV7000を用いてスフェロイドの撮像・解析が出来るかを試みました。具体的には、Z軸方向に複数枚取得した画像を2次元の画像データに再構成※し、スフェロイドの最大直径や含まれる細胞数による評価を行いました。このように、CV7000の高速な3D撮像とProjection機能を組み合わせることにより、3次元のサンプルでも効率よく解析することができ、さらに、ライブセルに応用することで、時系列での評価など新しい実験系の確立も可能です。
※Maximum Intensity Projection (MIP) にて再構成

Original image

図1 (a) 原画像
Z軸方向に10µm間隔で12枚撮影し、MIP※表示したもの
(a’)は一部拡大した画像 

拡大画像

Recognition image

図1(b) 認識画像
解析ソフトウェアを使用して(a)の画像について、スフェロイドの輪郭(紫)と含まれる個々の細胞(青)を認識した画像
(b’)は一部拡大した画像

拡大画像

Tile image

図2(a) XY方向に50pixelのオーバーラップを含ませてウェル全体を撮影したTile画像(25枚)

拡大画像

Tile image

図2(b)(a)のTile画像をオーバーラップ部分を元につなぎあわせて1枚とした画像

拡大画像

 

実験方法

  1. スフェロイド形成培養容器(EZSPHERE ® 、AGCテクノガラス株式会社)に、Azami-greenを発現させたHeLa細胞(5×105cells/dish)を播種し、7日間培養してスフェロイドを形成
  2. スフェロイドを回収して固定後、96wellプレートに播きなおして、CV7000にて下記条件で画像取得:
    ・倍率:10倍Dry
    ・波長:488nm
    ・露光時間: 250msec
    ・Z軸方向 : 110µmを10µm間隔にて12枚撮影
    ・1平面あたりの取得画像数 : 25枚
     (Tile機能を使用してウェル全体を撮影。1ウェル当たりの撮影所要時間 約1分半。)
  3. 解析ソフトウェアを用いて、MIP画像よりスフェロイドの最大直径とそこに含まれる細胞数を数値化、Spotfire®にてグラフを作成

 

Experiment

 

結果とまとめ

EZSPHERE®は、細胞培養容器の培養面に微細な穴を施し、表面を細胞低接着性の特殊ポリマーでコートしています。そのため、播種された細胞はウェル内で均一なスフェロイドを形成します。ウェルの穴の径や深さが異なる6種類(4000-900,-901,-902,-903,-904,-905)のディッシュを使用してスフェロイドを作成し、CV7000での撮影・解析を試みました。その結果、スフェロイドの最大直径と含まれる細胞数について、穴の径や深さから予測されるスフェロイドの大きさに相関したデータが得られました。このように、スフェロイドのような3次元のサンプルに対しても、効率よく評価を行うことが可能です。

)Images at 0.2 sec. interval extracted from the images of 2.6 sec. after start up to 5.4 sec. Ionomycin was added at 3.0 sec. from the start.(Red-framed image)

図4(a) 各ウェルのTile画像 (画像中の数字は使用したディッシュの品番)
900 (直径 : 500µm/深さ : 100µm) , 901 (直径 : 200µm/深さ : 100µm)
902 (直径 : 500µm/深さ : 200µm) , 903 (直径 : 800µm/深さ : 300µm)
904 (直径 : 800µm/深さ : 400µm) , 905 (直径 : 1,400µm/深さ : 600µm

 

Spheroid diameter

図4(b) スフェロイドの直径

Number of contained cells

図4(c) スフェロイドに含まれる細胞数

Spotfire®はTIBCO Software Inc. の登録商標です。

 


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