横河電機株式会社
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CQ1 アプリケーション

CQ1アプリケーション


細胞周期解析

Cell cycle Cell cycle

DNAに結合する蛍光色素を用いて、細胞個数や核の体積と総蛍光量(DNA量を反映)から細胞周期を判定します。

Cell cycle analysis

落射型では判定できない密集した細胞でも、三次元解析することでの細胞周期を判定できます。

3D imaging of confluent A549 cell(lung carcinoma)
高密度培養したA549肺がん細胞株を3D撮像

プロトコル

Image data Recognition Total intensity Draq7 in DNA
撮影画像   認識画像   (Draq7蛍光量)

 

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スフェロイド解析

スフェロイド→細胞で認識することで、スフェロイドの情報だけでなく、スフェロイド内の個々の細胞を一度に 測定することができます。

Spheroid

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血中癌細胞(CTC)

血中癌細胞(CTC)は末梢血中を循環しているがん細胞です。CTCの有無を測定することで、早期にがんの転移・再発を診断することができます。血液10ml当たり数10万個以上存在する細胞のうち、がん細胞は数10個程度しか存在しません。ターゲットの割合が非常に少ない場合、フローサイトメーターで検出することは極めて難しいですが、CQ1を使用することでわずか数個存在するがん細胞を特異的に検出することが可能になります。

CTC

CTC

A.上皮系マーカー(AE1/AE3: FITC標識)
B.がん幹細胞マーカー(CD133: Texas Red標識)
C.上皮系マーカーとがん幹細胞マーカーの2重染色(AE1/AE3*CD133)

データご提供:帝京大学医学部外科学講座 飯沼久恵先生

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顆粒解析

wortmanninによるγH2AXの顆粒形成阻害

HeLa細胞にWortmannin存在下で1mMのH2O2を添加し、45分間処理しました。細胞を固定した後、Hoechst33342による核染色と、抗γ2AX抗体を使用した免疫染色を行いました。CQ1にて撮影を行い、解析は顆粒解析テンプレートを使用しました。グラフは核内に含まれるγH2AX顆粒の総蛍光強度の1well当たりの値を示しています。 グラフ中のエラーバーは各濃度ごとのSE値を表しています。(n=5well)

Granule analysis

Granule analysis

顆粒解析:GPCR

GPCR(G-Protein Coupled Receptor:Gタンパク質共役型受容体)は細胞膜に存在し、細胞外のシグナルを、Gタンパク質を通して細胞内に伝える役割をしています。GPCRにリガンドが長期にわたり結合すると、ベシクルとして細胞膜から細胞質中に引き込まれエンドソームを形成し、neurokinin-1受容体(NK1R)では脱感作が生じます(インターナリゼーション)。
細胞内ベシクル(顆粒)の数を特徴量として抽出することで、顆粒数の増減で化合物のスクリーニングや機能解析をすることができます。

Granule analysis

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細胞輸送能解析

Scratch assay

スクラッチアッセイは細胞の増殖能、浸潤能を測るための基本的なアッセイ手法の一つです。CQ1のマルチカラー、タイムラプス撮影機能で、細胞増殖と遊走によりスクラッチ部分が埋められていく過程を経時的かつ定量的に解析できます。

Scratch assay

Scratch assay

Fucci-HeLa細胞を播種したウェルにScratchを施し、MitomycinC処理(細胞周期停止処理)後、CQ1にて3日間のタイムラプス撮像を行った。
MitomicinC処理をしない場合は、S/G2/M期、G1期の細胞が増加し、細胞分裂しながらScratchの溝を埋めたが、MitomicinC処理をした場合はG1期の細胞が減少し、細胞遊走のみでScratchの溝は埋められた。

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細胞増殖判定

Cell Proliferation

測定による光毒性・退色が少ないため、培養の途中に測定し、細胞の育ち具合(細胞個数・面積・輝度など)を評価することができます。
2倍の対物レンズを使うことで、96ウェルプレートの1つのウェル全範囲を測定できます。

Cell Proliferation96ウェルプレートの撮影画像をウェル表示

Cell Proliferation
各ウェルごとの測定結果

Cell Proliferation  Cell Proliferation
細胞の面積の分布細胞の平均輝度の分布

Cell Proliferation
2倍レンズでのホールウェル撮影(1ショット)

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分化判定

Induction of differentiation Induction of differentiation

ヒトiPS細胞の品質評価
iPS細胞のスフェアのサイズや形態の情報と未分化レベルの指標となるマーカー発現の関連性を検討することにより、スフェアの品質を評価することができます。
また、従来から行われている面積等での品質評価の妥当性を確認することもできます。
データご提供:株式会社リプロセル様

Whole well tile image (x2 lens)
2倍対物レンズによる24ウェルプレートのホールウェルのタイル撮像

Uniform pluripotent state Non-uniform sphere
球形のスフェアは未分化が保たれている   一部未分化マーカーの発現が低くなっている 

X Axis:DNA amount per sphere Y Axis:Oct3/4 expression  X Axis:Sphere size (area) Y Axis:Oct3/4 expression
X軸:スフェアあたりの総DNA量         X軸:スフェア面積
   (Draq7総蛍光量 log)          (2次元画像上 log)
Y軸:スフェアあたりのOct3/4発現量   Y軸:スフェアあたりのOct3/4発現量
   (Alexa488蛍光量 log)         (Alexa488蛍光量 log)

スフェアあたりの総DNA量(スフェアサイズに相当)や面積が大きいほど未分化の細胞(未分化マーカーOct3/4が発現する細胞)の割合が少ない傾向にあることがわかります。
このほかスフェアの球形度で評価することもできます。 

細胞集塊の分化判定
細胞集塊を立体的に撮像し、三次元画像解析による細胞の個別認識を行ったうえでマーカータンパクの発現量の解析を行いました。細胞集塊をばらばらにすることなく、全体のタンパク発現量を得ることができます。同時に、個々の細胞のタンパク発現量や形態、位置情報などの詳細な情報も得ることができます。

Slice image

スライス像

Cell recognition

認識結果

細胞集塊中の個々の細胞の分化マーカーの発現量

Differentiation marker positive  Differentiation marker negative
分化マーカーの発現量が高い→分化              分化マーカーの発現量が低い→未分化

Undifferentiated  Partially differentiated  Partially differentiated
 未分化スフェア       一部分化しているスフェア    半分近く分化しているスフェア

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タイムラプス解析

Time lapse Time lapse

タイムラプス解析:ES細胞コロニーの測定
コロニーの大きさ、個々の細胞をタイムラプスで測定することで、コロニー化・分化の過程などを定量化できます。CQ1は低退色・低光毒性で測定ができるため、ライブセルの定量も正確に行えます。
データご提供:奈良県立医科大学 生理学第二講座 堀江恭二先生

ES colony, excerpt from time-lapse images taken at 30 min. interval.
タイムラプスの測定の一部を抜粋

ES colony

全タイムラプスの認識動画
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ES colony

全タイムラプスの3D動画 
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タイムラプス解析:アポトーシス

HeLa細胞にStauroporineを濃度を振って添加し(0~10uM)、6時間のタイムラプス撮影を行いました。
Staurosporine 10uMを添加したwellでは、 アポトーシスによる核の断片化が確認でき、数値化できました。

アポトーシス

Time lapse movie
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