Ionomycin 濃度依存的なカルシウム応答の解析

はじめに

Ca²⁺の濃度変化は細胞内シグナル伝達、筋細胞の収縮などの研究分野において重要な解析対象となります。ここではFluo4を負荷したA10細胞にCa²⁺のイオノフォアであるIonomycinを滴下し(Ionomycinの最終濃度をふって実験)、細胞内のCa²⁺濃度が増加する様子を撮像・解析した結果をご紹介します。

解析結果

CV8000 にて画像を取得し(図1a～1c)、解析支援ソフトを使用して細胞内Ca²⁺濃度の経時変化を解析しました。解析支援ソフトでは個々の細胞を認識して解析を行うため、1 つ1 つの細胞の経時変化に関するデータを得ることができます(図2a)｡そのため、明らかに異常な反応を起こしている細胞を除外したり、特徴的な反応を起こしている細胞のみを解析することも可能です。さらに、ウェルごとに滴下する試薬の種類や濃度を変化させることにより、それに応じた細胞の反応の違いなども解析することができます(図2b、2c)。

1(b)

図1a.撮影開始2.6 秒後から5.4 秒後までの0.2 秒間隔の画像 Ionomycin の滴下は撮影開始3.0 秒後( 赤枠の画像)
図1b. タイムラプス動画

*全てのグラフのデータは撮影開始2.9秒後の蛍光強度を0にあわせてあります。

測定・解析方法

試料準備

A10細胞を96ウェルプレートに10,000 cells/well で播種して一昼夜培養後、Ca²⁺インジケーターであるFluo4を負荷。(最終濃度1μM、20分間)

撮像

タイムラプス画像を取得。

• タイムラプス撮像の条件
  • 倍率: 20 倍
  • 露光時間: 100msec
  • 撮影間隔: 100msec 間隔で20秒間
  • Ionomycin滴下：撮影開始3秒後にIonomycin 50μM を滴下
  • Ionomycin最終濃度: 0~5μM
  • 1wellあたりの取得画像数：1枚(ウェルの中心)
• Ionomycin滴下条件
  • Air gap: 30μl
  • Aspirate volume: 50μl
  • Aspirate speed: 33μl/sec
  • Dispense volume: 80μl
  • Dispense speed: 22μl/sec
    

分注設定

Sourceプレート(Ionomycin)の各ウェルからAssayプレート(A10 細胞)の各ウェルへ1対1でIonomycinを分注。.

解析

解析支援ソフトを使用して、以下の条件で解析。解析後のグラフ描画はSpotfire®を使用。

• Binarization: Sigma Threshold Object Diameter [25] Sigma [100]
• Binary Transform: Opening Circle Circle Radius [7]
• Labeling: Divide Each Region Watershed Threshold [50] Select Region For Area MinArea [640] MaxArea [999999]
• Logical Operating: Region Operator Region1 [After Labeling] Operator Type [EXPAND] Region2 [Cytoplasm]

Spotfire®はTIBCO Software Inc. の登録商標です。

 

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