横河電機株式会社
横河ソリューションサービス株式会社

Ionomycin 濃度依存的なカルシウム応答の解析

はじめに

Ca2+の濃度変化は細胞内シグナル伝達、筋細胞の収縮などの研究分野において重要な解析対象となります。ここではFluo4を負荷したA10細胞にCa2+のイオノフォアであるIonomycinを滴下し(Ionomycinの最終濃度をふって実験)、細胞内のCa2+濃度が増加する様子を撮像・解析した結果をご紹介します。

解析結果

CV8000 にて画像を取得し(図1a~1c)、解析支援ソフトを使用して細胞内Ca2+濃度の経時変化を解析しました。解析支援ソフトでは個々の細胞を認識して解析を行うため、1 つ1 つの細胞の経時変化に関するデータを得ることができます(図2a)。そのため、明らかに異常な反応を起こしている細胞を除外したり、特徴的な反応を起こしている細胞のみを解析することも可能です。さらに、ウェルごとに滴下する試薬の種類や濃度を変化させることにより、それに応じた細胞の反応の違いなども解析することができます(図2b、2c)。
Images at 0.2 sec. interval extracted from the images of 2.6 sec. after start up to 5.4 sec. Ionomycin was added at 3.0 sec. from the start.(Red-framed image)
1(b)
Ionomycin

図1a.撮影開始2.6 秒後から5.4 秒後までの0.2 秒間隔の画像 Ionomycin の滴下は撮影開始3.0 秒後( 赤枠の画像)
図1b. タイムラプス動画

Average fluorescence intensities of individual cells in each well

図2a. 各ウェルの細胞個々の平均蛍光強度

Average of the average fluorescence intensities for individual cells in each well

図2b. 細胞個々の平均蛍光強度をウェルごとに細胞間で平均

: Average of the average fluorescence intensities for individual cells at varying concentrations

図2c. 細胞個々の平均蛍光強度を同じ濃度条件(横列) で平均

*全てのグラフのデータは撮影開始2.9秒後の蛍光強度を0にあわせてあります。

測定・解析方法

試料準備

A10細胞を96ウェルプレートに10,000 cells/well で播種して一昼夜培養後、Ca2+インジケーターであるFluo4を負荷。(最終濃度1μM、20分間)

撮像

タイムラプス画像を取得。

  • タイムラプス撮像の条件
    • 倍率: 20 倍
    • 露光時間: 100msec
    • 撮影間隔: 100msec 間隔で20秒間
    • Ionomycin滴下:撮影開始3秒後にIonomycin 50μM を滴下
    • Ionomycin最終濃度: 0~5μM
    • 1wellあたりの取得画像数:1枚(ウェルの中心)
  • Ionomycin滴下条件
    • Air gap: 30μl
    • Aspirate volume: 50μl
    • Aspirate speed: 33μl/sec
    • Dispense volume: 80μl
    • Dispense speed: 22μl/sec
      Ionomycin滴下条件

分注設定

Sourceプレート(Ionomycin)の各ウェルからAssayプレート(A10 細胞)の各ウェルへ1対1でIonomycinを分注。.
分注設定

解析

解析支援ソフトを使用して、以下の条件で解析。解析後のグラフ描画はSpotfire®を使用。

  • Binarization: Sigma Threshold Object Diameter [25] Sigma [100]
  • Binary Transform: Opening Circle Circle Radius [7]
  • Labeling: Divide Each Region Watershed Threshold [50] Select Region For Area MinArea [640] MaxArea [999999]
  • Logical Operating: Region Operator Region1 [After Labeling] Operator Type [EXPAND] Region2 [Cytoplasm]

Spotfire®はTIBCO Software Inc. の登録商標です。

 


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