共焦点スキャナユニット

はじめに

　凍結解凍後に細胞が受けるダメージは、氷の成長に伴う電解質の濃縮の影響を受けます。細胞外の電解質濃度が上昇すると浸透圧が上昇し、その結果、細胞は脱水収縮します。その速度は細胞膜の水透過率に依存し、その速さが細胞の凍結損傷のメカニズムに大きな影響を及ぼすと考えられています。
　従来の顕微鏡を用いた細胞の浸透的挙動の観察では二次元的な情報しか得られず、脱水収縮速度を求める場合には、液中に浮遊した状態の単離細胞を試料として、投影面積から体積を推定してその変化から算出するしかありませんでした。
　そこで、周囲の溶液濃度変化に対する細胞の応答を観察できる灌流顕微鏡に高速スキャンが可能な共焦点スキャナユニットを導入し、細胞の脱水収縮挙動を三次元的に実時間観察しました。そして、単離細胞に加えて付着状態の培養細胞の観察を行い、比較しました。

図1　浮遊状態の細胞の脱水収縮挙動
画像処理後の細胞の三次元再構築像を上から見たもの(上段)と横から見たもの(下段）

図2　付着状態の培養細胞の脱水収縮挙動
画像処理後の細胞の三次元再構築像を上から見たもの(上段)と横から見たもの(下段)
Z方向にのみ収縮することが確認できます

図3　等張液中の細胞の表面積(付着状態の場合には頂端部側のみの表面積)と体積の関係

図4　体積の経時変化の測定例
NaCl の濃度(C) が高くなるにつれ、浮遊細胞は全体的に、培養細胞は高さ方向にのみ収縮しますが、どちらもほぼ同程度の時間で収縮し、水透過率(Lp) にはほとんど差はありません

実験内容

下記の条件で浮遊状態および付着状態の細胞の脱水収縮挙動を観察しました。

結果

　高浸透圧溶液に曝されると、浮遊細胞は三次元的に、しかしややいびつに収縮しましたが(図1)、培養細胞は基質への接着面積を維持したまま高さ方向にのみ収縮しました(図2)。また、浮遊細胞の表面積と培養細胞の頂端部側の表面積はほとんど等しいことが明らかになりました(図3)。さらに、細胞の体積変化を測定したところ(図4)、細胞膜の見かけの水透過率にもほとんど差がないことがわかりました。

まとめ

　共焦点スキャナユニットCSU で高速観察することで、今まで見ることのできなかった三次元形態変化を解明することができました。共焦点スキャナユニットCSU-X1は世界最速2000fpsで高精彩に観察できるため、素早い動きを詳細に観察することができます。

データご提供：九州大学 大学院工学研究院 機械工学部門 教授 髙松 洋 先生
参考文献：
Yoshimori T, Takamatsu H, 3-D measurement of osmotic dehydration of isolated and adhered PC-3 cells, Cryobiology 2009, 58(1): 52-61.

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ミトコンドリアの超解像リアルタイムライブセルイメージング

画像ご提供：産業技術総合研究所　バイオメディカル研究部門　加藤薫先生

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はじめに

受精・初期胚発生過程では、様々な現象が時空間的に制御され、かつそれらの多くが「個体発生」という最終目標に向かって原因と結果という関係で結ばれています。その作用機序を解析する上で、細胞の固定や破壊を必要とする従来の実験手法では限界がありました。この問題を解決するには、一連の過程を経時的に観察でき、かつ観察後も引き続き個体まで発生させることが必要です。そこで、個体発生にダメージを与えない初期胚長時間多次元ライブセルイメージング技術の確立を目指しました。

図1　初期胚長時間多次元ライブセルイメージング技術は胚の個体発生に影響しない
(a)実験の流れ
(b)ムービーの代表的な例
ここでは紡錘体を緑に(EGFP-α-tubulin) 核を赤に(H2B-mRFP1) にラベルしてある
写真はZ 軸方向に51 枚ある画像を最大輝度合成によって1 枚の画像に変換し、7.5 分おきに撮影したものから2 時間間隔で抜粋
(c)約6万枚近くの蛍光画像を取得した胚を移植して生まれた仔とその仮親

実験内容

マウス受精卵にEGFP-α-tubulin およびHistone H2B-mRFP1 のmRNA をマイクロインジェクションし、3 時間インキュベーションした後にCSU10 を付加した顕微鏡システム(図2) にセットしました。着床前初期胚発生過程について約70 時間に及ぶ長時間の3次元イメージング(詳細な撮影条件は表参照)の後、胚盤胞期胚を仮親の子宮に移植しました(図1a)。

 

No.	Devices	Manufacturer	Model
1	Inverted fluorescence microscope	Olympus	IX71
2	Nipkow disk confocal unit	Yokogawa	CSU10
3	EM-CCD camera	Andor	iXON DV887-BV
4	Z motor	Ludl	Mac5000
5	XY auto stage	Sigma Koki	XY30100T
6	CO2 incubator	Tokai hit	MI-IBC
7	Filter wheel	Ludl	Mac5000
8	Software	Molecular Devices	MetaMorph

結果

受精直後から胚盤胞期までの長時間イメージングに成功しました(図1b)。イメージング後の胚(計6万枚近くの蛍光画像を取得) を移植した結果、正常に産仔が得られました(図1c)。得られた産仔は健康に育ち、生殖能力を有していました。以上から、本初期胚イメージング技術は個体発生にダメージを与えないことが明らかとなりました。

まとめ

CSU を用いることで、細胞に対して極めて低毒性の長時間多次元イメージング技術を確立することができました。これは、サンプルに当たる励起光が極端に弱いというCSUの特徴によるものと考えられます。この技術革新により、ライブセルイメージングにより細胞をただ「見る」だけだった時代から、イメージング後にさらにその細胞を別の解析法に 「活用する」時代に移ったのではないでしょうか。今後はイメージングをもとに遡及的・予後予測的に細胞現象の原因と結果を関連付ける研究がさかんになると考えられます。

データご提供：理化学研究所　発生・再生科学総合研究センター　若山照彦研究室　研究員　山縣一夫先生
参考文献：Yamagata, K., Suetsugu, R. and Wakayama, T. Long-term, Six-dimensional Live-cell Imaging for the Mouse
　　　　　Preimplantation Embryo That Does Not Affect Full-term Development. J. Reprod. Dev. In press 2009; 55: 328-331
　　　　　顕微鏡活用なるほどQ&A　羊土社　宮戸健二、岡部勝　編集

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「生組織イメージング」でみる肥満脂肪組織リモデリング

　脂肪組織は長年「何もしない臓器」と考えられてきました。しかし、近年のライフスタイルの変化( 食生活の欧米化) に伴う肥満・メタボリックシンドロームの蔓延により、脂肪組織は様々な病気を引き起こす「活発な代謝臓器」として一躍、注目を浴びるようになりました。メタボリックシンドロームの病態解明を目指し、肥満に伴う脂肪組織の再構築( リモデリング) と機能異常に注目してイメージング手法を用いた検討が行われています。
　従来の切片標本を用いた観察では、脂肪組織における血管や組織間質に存在する細胞群の三次元的構造の詳細は不明であり、生体内の動態も明らかではありませんでした(図1a)。
そこで脂肪組織をよりよくみるために、スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いて、生きたままの組織をそのまま染色する「生組織イメージング手法」を実施しました。

図1　生組織イメージング手法でみる脂肪組織
a:従来の脂肪組織切片標本、正常動物(db/+ マウス) 血管構築など詳細な構造は不明です
b、c: 新たに開発した生組織イメージング手法によりとらえた、8週齢痩せ型マウス(db/+) の白色脂肪組織像
　青: 脂肪細胞、赤: 血管内皮、緑: 核
　詳細な組織構築が三次元的に明瞭に描出されています
d:8週齢の肥満動物(db/db) 脂肪組織
　肥大した脂肪細胞とともに小型脂肪細胞分化と血管新生( 矢印) を認めます

実験内容

1.麻酔下のマウスに蛍光色素を静脈全身投与
2.組織をマウスより取り出し、未固定のまま細かく切り出す
3.蛍光色素の入った培養液中でインキュベートし、生きたまま蛍光標識
4.脂肪細胞は蛍光標識された脂肪酸で、血管内皮は蛍光標識レクチンで、核はヘキストで染色
5.共焦点レーザ顕微鏡により観察

結果

　本手法を用いて、肥満に伴う脂肪組織リモデリングの詳細が明らかになりました(図1b-d）。 肥満の形成には血管新生が必須であり、脂肪細胞分化は免疫細胞(マクロファージ)・血管 内皮細胞との相互作用の元で生ずる事がイメージングにより示されました。
　これらの組織構築・細胞連関は、厚みのある脂肪組織をそのまま三次元的に画像取得 することで初めて可視化されます。

まとめ

　これらのイメージング手法を用い、立体的な微細構造を生体内で明瞭に描出するとともに、 組織・細胞の機能・動態を直接観察することができます。
　本手法により、肥満に伴う脂肪細胞の再構築( リモデリング) と機能異常が可視化されました。

「生体内分子イメージング」でみる肥満脂肪組織と慢性炎症

　心筋梗塞や脳血管疾患などの動脈硬化性疾患のリスク要因として、内臓肥満とインスリン 抵抗性を基礎とするメタボリックシンドロームが注目されています。
　近年、メタボリックシンドロームは内臓肥満が引き起こすことが明らかになりました。 内臓肥満は慢性炎症に伴い脂肪組織の再構築(リモデリング) をもたらします。リモデリング した脂肪細胞は、組織機能異常から全身のインスリン抵抗性をもたらし動脈硬化病変を 進展させ新血管イベントを引き起こすと考えられます。
　従来、様々な病態に対する実験的アプローチとして、細胞レベル(in vitro)・個体レベル (in vivo) それぞれが独立した実験系により評価されてきました。この両者を結びつけるため には、「個体で細胞をみる」ことが非常に重要であると考えられます。
　「生体内分子イメージング手法」により全身臓器の微小循環、細胞動態が可視化されます。 動脈硬化のように血管が主な傷害の場になる病態だけでなく、腫瘍やメタボリック シンドロームにおいても、細胞動態・血流・血管機能といった生体内のダイナミックな 変化をとらえることは非常に有用であり、組織学的変化に先行する肥満に伴う初期の炎症 性変化を捉える事が可能となります(図2)。

図2　共焦点顕微鏡を用いたマルチカラー生体内分子イメージング
a: 正常動物(ob/+ マウス) 脂肪組織中毛細血管での血流イメージ
　血管内を変形して流れる血球( 赤色は血小板) が明瞭に描出されている
　緑：FITC デキストラン、赤：抗CD41 抗体 　　　
b: 正常動物(ob/+ マウス) 及びc: 肥満動物(ob/ob マウス) 脂肪組織における細静脈の血流イメージ
　FITC デキストランにより可視化
　肥満脂肪組織では、血管壁への白血球・血小板の付着を認める( 図c 中矢印）
d: 肥満動物(ob/ob マウス) における白血球のrolling
　アクリジンオレンジにより可視化

図3　各種臓器への生体内分子イメージングの応用例(a: 骨格筋、 b: 肝臓、 c、d: 腎・糸球体の血流イメージ)

実験内容

1.麻酔下のマウスに蛍光色素を静脈全身投与し、観察部位を切開・露出
2.観察部位を生理食塩水により湿に蛍光色素を静脈全身投与し、観察部位を切開・露出
3.観察部位を生理食塩水により湿潤した後観察窓を設け、マウスを倒立顕微鏡上の チャンバーにおいて蛍光観察
4.共焦点レーザ顕微鏡により観察
   生体内の高速で起きる事象を捉えるには高速な画像取得は必須ですが、共焦点スキャナユニットCSU とEMCCD カメラを用いたシステムでは最小１ピクセル80nm、最短1フレーム1msec の高時間・空間解像度を達成しており、二波長励起二波長観測による同時マルチカラー撮影も可能です。

結果

　本手法を用いて、肥満脂肪組織における微小循環を検討したところ、血管壁への白血球・ 血小板のrolling・adhesion が増加していました。肥満脂肪組織中では血流が間歇的に 低下し、低酸素も認められ、血管内皮・白血球・血小板の相互の活性化が肥満に伴う 炎症を脂肪組織微小循環内で増幅していると考えらました。

まとめ

　これらのイメージング手法を用い、立体的な微細構造を生体内で明瞭に描出するとともに、 組織・細胞の機能・動態を直接観察することができます。
　本手法により、肥満に伴う脂肪細胞の再構築( リモデリング) と機能異常が可視化されました。

データご提供：東京大学循環器内科・TSBMI、JST さきがけ　西村 智先生
参考文献：
・生体外、組織イメージング 　1) Nishimura S, Manabe I, Nagasaki M, et al. Adipogenesis in obesity requires close interplay between differentiating adipocytes, stromal cells and blood vessels Diabetes 2007,56:1517-1526.
・生体イメージング 　2) Nishimura S,Manabe I, Nagasaki M, et al. In vivo imaging im mice reveals local cell dynamics and inflammation n obese adipose tissue J Clin Invest. 2008, 118(2): 710-721.

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はじめに

　脳が外界からの感覚情報をどのように知覚しているのかを理解するためには、生体内での個々の神経細胞（ニューロン）の活動をリアルタイムで、かつ脳の広範囲を同時観察することが要求されます。そのためには高空間分解能・高時間分解能かつ広視野でのイメージングを可能とする装置が必要です。
　今回は共焦点スキャナユニットCSU-W1とカルシウムセンサーGCaMPを用いることにより、ゼブラフィッシュ稚魚の脳内の活動を非常に高い分解能でイメージングすることができました。

図1 (a)タイムラプスの抜粋
全タイムラプス動画 再生

図1 (b)タイムラプスを時間で重ね合わせ
カルシウム反応が強くおきた箇所を赤く表示

図1 (c)GCaMP を発現させた脳部位（視蓋領域）の3D 画像

図1 (d)受精後5日目のゼブラフィッシュ稚魚 赤枠は視蓋領域

実験内容

　脳の視蓋領域にカルシウムセンサーGCaMPを発現させたゼブラフィッシュの稚魚（受精後3日目～5日目）をアガロース中に固定し、視蓋ニューロンの自発的な神経活動および視覚刺激依存的な神経活動をイメージングしました。

サンプル	Gal4-UASシステム*2を用いたUAS:GCaMP7aゼブラフィッシュ （受精後3～5日の稚魚）
システム	共焦点ユニット: CSU-W1 (pinhole: 50μm) レーザ: 488nm (solid-state laser) 顕微鏡: Axio Imager (Carl Zeiss) カメラ: iXon 888 (Carl Zeiss) 対物レンズ: W Plan-Apochromat 40x, W B-Achroplan 20x ソフト: Metamorph
撮影条件	視蓋部（深さ180μm）を100msec露光で600枚を連続撮影　 ータル152秒（3.94fps)

結果

共焦点スキャナユニットCSU-W1 を用いるとゼブラフィッシュ稚魚脳の広い範囲が単一視野内に収まるため、高い空間解像度で視蓋の個々の神経細胞の活動を同時観察でき（図１）、与えた視覚刺激に特異的に反応するニューロンを同定できました。また、脳深部（深さ300μm）からの神経シグナルも観察可能であることがわかりました。

まとめ

生体脳の神経細胞集団のネットワーク活動を可視化することにより、、神経細胞同士の機能的結合を調べることが可能になります。カルシウムセンサーを視蓋のみならず他の領域でも発現させれば、脳の領域をまたぐような機能的神経回路の解析においても共焦点スキャナユニットCSU-W1 が威力を発揮すると考えられます。また、より高速なカメラを選択することによりさらに時間分解能を上げることができます。

*1　視蓋：中脳の一部で、魚類では視覚情報処理や運動に関与する
*2　Gal4-UASシステム：酵母の転写因子GAL4とその標的配列であるUASを使った転写調節機構で、導入遺伝子を特定の部位で発現させることができる

データご提供：国立遺伝学研究所 初期発生研究部門　教授 川上　浩一 先生、助教 武藤　彩先生
参考文献：Muto et al., Real-Time Visualization of Neuronal Activity during Perception, Current Biology 23(4):307-311

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はじめに

気孔とは葉の裏側などに多く存在する間隙であり、植物と大気環境との接点としてガス交換や水分調節を担う重要な器官です。気孔の開閉は光や湿度などの周囲の環境変化に応じて厳密に制御されており、これは気孔を形成する一対の孔辺細胞の膨圧運動によって実現されています。すなわち、孔辺細胞が膨張すると気孔は開き、逆に収縮すると気孔は閉じます。この気孔開閉運動の機構解明は細胞生物学における中心課題であるばかりでなく、植物の炭酸同化作用を通じた大気環境改善に向けた基礎研究と位置づけられます。
本研究では、気孔開閉における孔辺細胞の細胞内構造・オルガネラの動態を明らかにすることを目的に、ライブイメージング法により立体画像(XYZN) および経時画像(XYT)の取得と解析を行いました。

実験内容

1. 各種の細胞内構造・オルガネラを蛍光タンパク質によって可視化した播種後5～7 週目のシロイヌナズナ形質転換体から成熟ロゼット葉を採取
2. 葉の裏側の表皮を剥離し、basal buffer に浮かべてプレパラートを作製
3. 共焦点ユニットCSU による顕微鏡システムを用いて画像取得
   
    

   システム	共焦点ユニット	CSU10
   	レーザ	488nm 半導体レーザ (HPU-50101-PFS2, 古河電工) 561nm半導体励起固体レーザ (85-YCA-025-040,CVI Melles Griot)
   	顕微鏡	IX70（オリンパス）
   	カメラ	CoolSNAP HQ (PhotoMetrics)
   	対物レンズ	UplanApo 100x/1.35 oil (オリンパス)
   	ソフト	Metamorph 7.0 (Molecular Devices)
   撮影条件		露光時間：0.5-1.0 sec (1090x762 pixels) 3Dデータ取得条件：10-20画像/1立体 (0.5μmステップ)

    

結果

15種の細胞内構造・オルガネラについて孔辺細胞の立体構造を複数(50～500 細胞対)撮像しました(図A)。本研究で取得した立体画像は東京大学大学院・馳澤研究室の顕微鏡画像データベースとして公開予定です。また、気孔開閉に応じてアクチン繊維の配向と束化状態が変化することを見出しました(図B)。さらに、アクチン繊維を経時的に観察した結果、1～2秒のうちに配向をおよそ60度も変化させるダイナミックな動きを捉えることが出来ました(図C)。

(A)孔辺細胞における細胞内構造・オルガネラの網羅的ライブイメージングの一例
　　細胞表層から細胞中央部までを捉えた連続光学切片の最大輝度投影像を示す
　　 a: アクチン繊維(GFP-ABD2)、 b: 微小管(GFP-tubβ)、 c: 液胞膜(GFP-AtVAM3)、 d: 細胞核(HistoneH2B-tdTomato)、
　　 e: 小胞体(GFP-ER）、 f: ゴルジ体(ERD2-GFP）、 g: エンドソーム(ARA6-GFP）、 h: ミトコンドリア(mt-GFP)
(B)気孔開閉時のアクチン繊維の立体構造
(C)孔辺細胞におけるアクチン繊維の動態観察
(D)お使いのCSUシステム

まとめ

本研究により、孔辺細胞における細胞内構造・オルガネラの動態を記録することができました。また、アクチン繊維の高次構造変化が気孔開閉運動に重要な役割を果たすことが示唆されました。
近年、画像解析技術の発達によって生物の多次元的な情報を効率的に捉えられるようになり、大規模な顕微鏡画像取得の必要性はますます高まっています。CSU を利用した本システムは、スループットの高い画像取得法のひとつとして有用と考えられます。

データご提供：データご提供：東京大学大学院新領域創成科学研究科、BIRD JST　桧垣匠先生、馳澤盛一郎先生
参考文献：Higaki T, Sano T, Hasezawa S, Actin microfilament dynamics and actin side-binding proteins in plants.　2007, Curr Opin Plant Biol 10:549-556.

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共焦点スキャナユニットCSU-X1の論文リストです

はじめに

ニューロンは巨大回路システムの機能素子です。したがって回路の挙動様式や作動原理を解明するためには、膨大数のニューロンの活動を一斉に、かつ細胞個々の個性を損なうことなくモニターする必要があります。
多ニューロンCa²⁺ 画像法(functional multineuronal calcium imaging、fMCI) は、ニューロンの細胞体の一過性Ca²⁺上昇がスパイク出力を反映していることを利用して、光学的にスパイク時空パターンを再構築する手法です。fMCI は数百個のニューロンの活動を同時にモニターできるため、神経ネットワーク研究に有用な知見をもたらす新世代の大規模記録法として注目を集めています。

実験内容

1. ラット・マウスの海馬・大脳皮質スライス(350-430μm 厚)を準備
2. 蛍光指示薬をロード(10μM 溶液中37℃で約60 分) 　
   Oregon Green 488 BAPTA-AM もしくは Fluo-4AM
3. 共焦点スキャナユニットCSU で画像取得
   フレーム速度：10～2000fps、対物レンズ：16～20 倍、NA：0.85～1.00

結果

多数(1000 個以上) のニューロンから一斉にCa²⁺蛍光強度をモニターすることができました。
スパイク活動の時空パターンを大規模に再構築することが可能になりました(fMCI 法）。

まとめ

これまで脳波の研究では、CA3 で記憶の固定などが行われるときには、リップル波(ripple) という脳波が出現することがわかっています。fMCIによる観察によって、CA3のニューロンの活動によるリップル波のメカニズム解明が期待されます。
共焦点スキャナユニットCSU-X1を搭載した共焦点顕微鏡システムを使えば、最速2000fps で画像形成できます。

データご提供：東京大学大学院薬学研究科　准教授　池谷 裕二先生

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共焦点スキャナユニットCSU-W1の論文リストです

マウス初期胚のタイムラプスイメージング

タイムラプス動画（MIP表示） 再生

撮影条件
Z撮影枚数	100um（1um/101slices)
励起波長	488nm：H2B-EGFP 561nm:mCherry-MBD-NLS
ピンホール	50um
対物レンズ	60x シリコン
撮影時間	48 時間(10分間隔)

タイムラプス（染色体：MIP表示）の一部を抜粋

画像ご提供：大阪大学　微生物病研究所　山縣一夫先生